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離心機在血清脂蛋白分離上的技術(shù)應(yīng)用

更新時間:2011-07-19      點擊次數(shù):3898

        血清脂蛋白是由血液中脂質(zhì)與某些特異的蛋白質(zhì)組成的一類不均一的復(fù)合物。因其所含脂與載脂蛋白的比例不同,其密度范圍在0.96g/ml或更低至1.21g/ml之間。紙電泳中顯示四條帶即:乳密顆粒,極低密度脂蛋白,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白。每種脂蛋白還可以分為更多的亞組分。
 用電泳法分離含載脂蛋白較高的組份(HDL,VHDL)比較成功,而離心分離法則適合用于各種密度的血清脂蛋白分離。

一.梯度材料:血清脂蛋白密度較低,常用的梯度材料為Nacl,NaI,Kbr,KI等,常用的緩沖劑為ED。

二.預(yù)分離:
1.
血細胞與血清分離:
 離心參數(shù):全血,角轉(zhuǎn)頭,3,000rpm×20min
 結(jié)果:沉淀為血細胞,上部為血清。
2.
乳糜粒分離:禁食12小時以上人血漿中乳糜粒含量極少,已進食者因其血漿含乳糜粒高,應(yīng)先離心去除乳糜粒。
 離心參數(shù):4 ×10 (g×min),10°C.各種轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速均可。
 梯度液配置:離心管下部3/4容積加血漿,上部1/4容積加0。5MnaCl+0.3MEDTA,ph7.4
 結(jié)果:乳糜粒上浮,吸出。
3.
血清蛋白分離:除去球蛋白,白蛋白及其它蛋白質(zhì)。
 離心參數(shù):(2。5-3)×10 (g× hr), 各種轉(zhuǎn)頭均可。如角轉(zhuǎn)頭70,000rpm× 6hrs,10°C
   配置:管容量1/3為血清,2/3為1。31g/ml,NaCl+NaBr,攪拌后終密度為1。21g/ml
   結(jié)果:管上部1/6容積為血清脂蛋白,下部5/6為其它蛋白。

三. 方法:
1
. 順序浮選法:
a)
超速法:zui早使用的方法,4000rpm×24hrs×3次,10°C
NaCl+NaBr
梯度按1。006,1。063,1。21順序浮選,每次在管上部取出不同密度之脂蛋白。操作簡單,分辨率高,得率高,費時,成本高。
b)
超高速法:100,000rpm×2.5hrs×2次,10°C, 100,000rpm×4hrs×1次,NaCl+KBr+EDTA梯度按不含密度浮選出VLDL ,LDL,HDL

2
. 單次離心法:
a)
單次甩平分離
   用zui高轉(zhuǎn)速為25,000~28,000 rpm,6×40ml甩平轉(zhuǎn)頭以1.006g/ml NaCl液及1。35g/ml(NaCl+KBr+EDTA)液配置成從 1。006至1。21的8層不連續(xù)階梯度,zui下部用血清與KBr配成1。25g/ml樣品液,25,000rpm×4hrs,4oC一次得到VLDL,LDL,HDL不同層區(qū)帶。
   用zui高轉(zhuǎn)速為40,000 rpm ,6×13ml甩平轉(zhuǎn)頭,40,000 rpm×24hrs,20°C,不連續(xù)KBr梯度1.006~1.21g/ml,細長管,分層清晰,回收率高,離心時間長
b)
單次垂直管分離:
NaCl/KBr
或NaCl/NaBr不連續(xù)梯度單管容量從5ml到40ml,轉(zhuǎn)速從50,000 rpm~80,000 rpm,離心(0。5-3)hrs,下層用KBr或(NaBr)將血清調(diào)至1。3g/ml上層用1.006g/ml,NaCl液,10°C-20°C,增加,減速一次分出。
 NaCl/Sucrose不連續(xù)梯度下層為48%W/W Sucrose,中層血清在4MnaCl中,上層為0。67M NaCl+0.05% EDTA,離心參數(shù)同上,時間較長。
c)
區(qū)帶轉(zhuǎn)頭大容量分離:
   離心參數(shù):區(qū)帶轉(zhuǎn)頭,zui高轉(zhuǎn)速30,000~48,000rpm, 容量從650ml~1900ml,每次可分離血清50-150ml,低速加樣及卸載,分離轉(zhuǎn)速:大轉(zhuǎn)頭(25,000-28,000rpm)×24hrs,小轉(zhuǎn)頭(30,000-38,000rpm)×1hrs,10°C-20°C
   梯度液:NaCl+NaBr或KBr+EDTA不連續(xù)或線性梯度,樣品在zui大密度層,近轉(zhuǎn)頭核心處用純水做隔離層,分離室zui外部用高密度NaCl/KBr或NaCl/NaBr作緩沖層。
   收集:泵出后依此經(jīng)帶流動地的紫外檢測儀檢測,自動部分收集器收集。

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